Príprava EMR roztoku
Nami použitý EMR roztok pozostáva z troch zložiek: fyziologický (fyziologický) roztok, obsahujúci vizuálnu kontrastnú pomôcku – sodnú soľ; [4-(alpha-(4-diethylaminophenyl)-5-hydroxy-2,4disulfophenyl-methylidene)-2,5cyclohexadiene-1-ylidene]Vnútorná soľ dietyl-amóniumhydroxidu (patentová modrá V, injekčný roztok 50 mg/2 ml, Courbet, Francúzsko)6 a koloidný modulátor rýchlosti -HES, (tiež známy ako hydroxyetylškrob) (VOLUVEN injekčný roztok, 1 x 500 ml, Fresenius Kabi, Bad Homburg, Nemecko)7 rozpustený. EMR zmes sme pripravili zmiešaním 500 ml izotonického soľného roztoku s 1 ml farebnej zmesi (patentová modrá V), následným zriedením HES natiahnutého do injekčnej striekačky s kombi zátkou (zátkou injekčnej striekačky) v pomere 3:7 pod aseptických podmienkach a v digestore s laminárnym prúdením aperogénne (zriedená uzavretá cesta).
Vhodný protokol výberu pacienta a manažmentu
Od 1. marca do 30. júna 2014 bolo odoslaných na EMR na Gastroenterologické oddelenie Ústrednej vojenskej nemocnice 62 pacientov (19 žien a 43 mužov s priemerným vekom 56,8 a 61,1 roka). Pacienti boli vyberaní na EMR buď priamo na gastroenterologickom oddelení alebo na odporúčanie lekára na inom gastroenterologickom pracovisku na Slovensku z dôvodu preventívnej prehliadky. Pacientom boli počas rutinnej kolonoskopie diagnostikované adenómy hrubého čreva a konečníka (diagnostická skupina ICD-10 kódy D 12.0, D12.2-D12.8) s ich najväčšou veľkosťou v rozmedzí od 5 do 40 mm. Rozmer. Kritériá vylúčenia pre polypektómiu (kontraindikácia EMR) boli krvné doštičky (PLT) menšie ako 50 × 109/l, pomer protrombínového času (INR) väčší ako 1,4, prerušenie antikoagulačnej alebo duálnej antikoagulačnej liečby do siedmich dní od EMR. Počet pacientov, ktorí podstúpili polypektómiu s EMR intervenciou (veľkosť vzorky n = 62), bol typický pre 4-mesačnú hospitalizáciu. Neboli použité žiadne iné výberové a/alebo vylučovacie kritériá. Nový kompozit EMR bol podaný všetkým pacientom vhodným na EMR.
Od všetkých pacientov bol získaný informovaný súhlas. Postup bol schválený Etickou komisiou Ústrednej vojenskej nemocnice SNP Ružomberok v súlade s platnou slovenskou legislatívou.8.
Vo všetkých prípadoch bol submukózny injekčný roztok pripravený v 10 ml injekčných striekačkách obsahujúcich izotonický fyziologický roztok, fyziologický roztok s epinefrínom alebo fyziologický roztok s metylénovou modrou alebo patentnou modrou V. Nová zlúčenina EMR bola vyrobená v rovnakom formáte 10 ml injekčnej striekačky. spomenuté vyššie.
Protokol podávania sa riadil rutinne používaným postupom a bol vykonaný v súlade s príslušnými smernicami a predpismi. Jedinou zmenou v protokole štandardného používania bolo nahradenie injekčných striekačiek obsahujúcich fyziologický roztok (fyziologický roztok), metylénovú modrú/patentovú modrú V a epinefrín injekčnými striekačkami obsahujúcimi čerstvú zlúčeninu.
Počas endoskopického sedenia bola priľahlá časť podozrivého tkaniva injikovaná submukóznou ihlou, čo viedlo k vytvoreniu bolusu v submukóze. V závislosti od veľkosti pôvodne pozorovaného polypu je objem injikovaného roztoku EMR 1–3 ml pre malé polypy s priemerom 5 mm, zatiaľ čo veľké lézie, napríklad 40 × 50 mm, vyžadujú 50–80 ml roztoku EMR. V objemoch EMR roztoku neboli žiadne významné rozdiely v porovnaní s konvenčnými objemami predtým používaných EMR roztokov. Keď boli nové polypy zvýšené a viditeľné v zornom poli, podľa potreby sa aplikoval ďalší EMR roztok. Zvýšené polypy sa odstránili pomocou polypektomickej slučky a odstránené tkanivo sa analyzovalo na histológiu. Mnoho polypov spravidla trvá niekoľko minút a odstránia sa v jednom kroku počas toho istého endoskopického sedenia. Rýchlosť disociácie N-bloku nebola významne odlišná pre čerstvý roztok. Vo všeobecnosti sa polypy s veľkosťou menšou ako 20 mm resekujú en-blok, zatiaľ čo nad touto veľkosťou je častejšia resekcia pomocou fragmentov. V niektorých prípadoch môžu byť polypy s veľkosťou okolo 30 mm odstránené ako celok.
Model bunkovej línie
Bunková línia ľudskej rakoviny hrubého čreva HCT116 bola zakúpená od American Type Culture Collection (ATCC, CCL-247) a kultivovaná v rastovom médiu RPMI 1640 (Biocera, Kansas City, MO, USA). Rastové médium bolo doplnené 10% fetálnym bovinným sérom (FBS) a 1 x Hyclone antibiotickým/antimykotickým roztokom (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) a udržiavané v atmosfére obsahujúcej 5% CO.2 vo zvlhčenom vzduchu pri 37 °C. Pred experimentmi sa životaschopnosť buniek analyzovala testom s trypánovou modrou. Bunková línia bola overená ATCC Laboratory Accreditation Service použitím Sangerovho sekvenovania. ATCC nevyhlásilo žiadnu kontamináciu mykoplazmami. Pred experimentmi boli vzorky buniek opätovne testované na kontamináciu mykoplazmami farbením DNA a fluorescenčnou mikroskopickou vizualizáciou.
Pre experimenty boli bunky nasadené na 96-jamkové platne s nízkou hustotou a udržiavané v kompletnom kultivačnom médiu počas 24 hodín. Bunky sa potom nechali hladovať vo fyziologickom roztoku bez živín počas 24 hodín, čo napodobňovalo prípravu pacienta pred operáciou EMR.
Počiatočná bunková kultúra bola pestovaná na 10 000 buniek na jamku a tvorili plaky. Počas hladovania sa niektoré bunky oddelili a voľne plávali v médiu. Voľne plávajúce bunky sme odstránili časťou kvapalného média a potom sme odstránený objem získali pridaním rovnakého objemu fyziologického roztoku. Hoci fyziologický roztok disociuje časť vyhladovaných buniek, významná časť vyhladovaných buniek zostáva pripojená k hustotnej platni po pridaní fyziologického roztoku.
Pridávanie rôznych prísad
EMR zlúčenina bola aplikovaná do dvoch skupín buniek – vyhladovaných a po 24 hodinách hladovania vo fyziologickom roztoku. Po 24 hodinách sa bunky bez hladovania prilepili na doštičku s hustotou, zatiaľ čo v bunkách s hladom sa museli voľne plávajúce bunky odstrániť a médium sa najskôr naplnilo fyziologickým roztokom. V oboch prípadoch je posledným krokom procesu nahradenie fyziologického média zmesou EMR. Pre vyhladované bunky bola polovica objemu fyziologického roztoku nahradená EMR. Odhadovaný objem fyziologického roztoku nahradeného zmesou EMR bol v rozsahu 100 μl. Potom sme pripravili sadu objektov bez farebnej zložky. Vo všetkých prípadoch boli bunky vystavené roztoku vizuálne hodnotené na počet buniek, veľkosť buniek a zmenu tvaru buniek na Citation 3 Cell Imaging Multimode Sensor (Biotech Instruments, Inc.) po 10 minútach živého vysielania videa.
